什么是化学发光

什么是化学发光？

化学发光是通过化学反应释放能量而产生的电磁辐射。虽然原则上光可以在紫外，可见或红外区域发射，但发射可见光的那些是最常见的。它们也是最有趣和最有用的。化学发光反应可分为三种类型：

使用合成化合物并且通常涉及高度氧化物质如过氧化物的化学反应通常称为化学发光反应。
由诸如萤火虫或水母之类的活生物体产生的发光反应通常被称为生物发光反应。
通过使用电流发生的发光反应被称为电化学发光反应。

化学发光和生物发光反应通常涉及OO键和有机过氧化物化合物的裂解或断裂。过氧化物，尤其是环状过氧化物，在发光反应中是普遍的，因为相对弱的过氧化物键易于裂解，并且所得的分子重组释放出大量的能量。

为了获得最高水平的灵敏度，化学发光反应必须尽可能有效地产生光子。每种化学发光化合物或基团可产生不超过一个光子的光。完全有效的反应将具有1的化学发光量子产率ΦCL，即根据等式反应的一个光子/分子：

ΦCL=ΦCE×ΦF×ΦR

化学激发量子产率ΦCE是在反应中产生电子激发态的概率，其值在0和1之间，0是完全黑暗的反应，当为1时，所有产物分子都在激发态产生。最有用的化学发光反应的ΦCE约为10 ^-3或更高。荧光量子产率ΦF是激发态通过荧光发射光子而不是通过其他过程衰变的概率。此属性的值介于0和1之间，通常至少为0.1。反应量子产率ΦR是经历发光反应而不是副反应的起始分子的分数。该值通常约为1。

当发射体荧光低ΦF时，可以增加化学发光的产率。在这些情况下使用高荧光受体以将激发能量从初级激发态化合物转移到荧光受体/发射体。然后通过以下等式确定化学发光量子产率：

ΦCL=ΦCE×ΦR×ΦET×ΦF'

能量转移量子产率ΦET表示将在反应中形成的初级激发态转换成受体的激发态的效率。该值通常接近1.受体/发射体ΦF'的荧光量子产率也应该接近1.

对化学发光反应的一些基本原理的理解将有助于理解如何设计化学发光测定。还可以讨论化学发光测量基础知识。

分析开发

在配体 - 粘合剂测定中使用发光化学反应进行定量检测是一个快速发展的领域。来自几个不同制造商的自动免疫分析仪正在商业上使用，还有一些正在开发中。这些测定市场的技术要求要求检测技术高度灵敏，不易过度干扰，坚固且易于使用。化学发光方法具有足够的灵敏度，因此非常适合这些应用。大多数分析是异质的并且需要分离结合与未结合的标记。这些测定法开发起来更简单，但执行起来有些复杂。相反，均相测定需要通过配体与其受体的结合以某种方式影响产生光的反应。

考虑到化学发光测定法日益普及的一个原因是其精确的检测灵敏度。与吸光度（比色）或荧光测量不同，测定样品通常很少或没有天然背景化学发光。背景信号的最严重来源来自通过非特异性结合事件非特异性地与分析物相关联的标记。在所有检测系统中都会出现此问题。光强度的测量相对简单，仅需要光电倍增管或光电二极管以及相关的电子器件来转换和记录信号。缺乏固有的背景和通过简单的仪器轻松测量非常低和非常高的光强度的能力提供了大的潜在动态测量范围。⁶或10 ⁷使用纯化的化合物和标准是常规的。

选择检测反应的因素

酶标签或直接标签？
产生化学发光的常用方法是使用标记酶来催化化学发光反应。每个标记可以引发多个化学发光反应，因此通常仅需要掺入一种或几种酶标记/分析物。化学发光化合物作为酶底物过量供应以确保饱和动力学。

光强度是标记酶量的线性函数。强度，即光子/秒的发射速率，是底物E + S→E + S'的催化转换（下面的步骤1-3）和发光化合物S'的寿命的产物→ P *（步骤4）。后一过程通常是具有速率常数k的一阶，并且可以通过其半衰期来表征

t _1/2 =（ln 2）/ k。

与其他步骤相比，激发态产物P *→P（步骤5）的寿命极短，并且对观察到的反应动力学没有影响。

反应动力学

化学发光强度/时间曲线包括初始上升期直至高原或假平台水平的延长发射。当S'→P *的一级反应较慢时，随着S'的稳态浓度达到，平稳的上升时间将延长。当S'→P *的反应很快时，会迅速上升并延长发射。没有稳定的平台值表明底物耗尽或酶失活。检测酶产生的化学发光在测量过程中提供了很大的灵活性。通过高原的任何时间点的光强度可以与酶的量相关。如果速度是单点或多点斜率类型测量的问题，则可以在上升部分期间进行测量。为了获得最大灵敏度

酶化学发光

在免疫测定中使用化学发光反应检测分析物的另一种方法是直接用化学发光化合物共价标记一个互补结合配偶体。触发化学发光标记以进行发光反应产生用于检测分析物的信号。这种方法具有更直接的优点，并且避免了使用大的，相对“粘性”标签的需要。然而，不存在许多合适的化学发光化合物。合适的候选者必须首先具有一些功能以允许与其他分子的连接。更重要的是，标签在触发时应尽可能在最短的时间内发出所有光。当化学发光在一段时间内逐渐发射时，信号强度（光子/秒）减少，

结合分子

待检测物种上化学发光标签的最佳数量最好根据经验确定。尽管理论上更多的标签应该提供更多的光子，但是如果标签间隔太近，则会发生淬火效应。表面积和可衍生基团的数量，通常是氨基或巯基，提供了进一步的限制。在实践中，最多可将10-20个标记掺入大分子中。此外，结合分子表面上的标记越多，标记越可能干扰其结合特性。

选择分析格式的因素

同质还是异类？
均相或非分离测定法是理想的，因为它们具有简单的混合和测量性质。当键结合事件（混合）调节信号产生（测量）而不需要分离结合和未结合的配体时，这可以实现。原则上，信号调制可以是几种类型中的任何一种。例如，化学发光标记的配偶体的补体可以用猝灭剂或波长变换剂或影响发射时间过程的物质标记。实际上，这种化学发光测定很难设计。有必要将反应的两个关键组分分别与相应的结合配偶体连接，并且它们相互作用以仅在结合事件发生时调节化学发光的产生，而不是当两个标记的组分在物理上存在于测定混合物中时未绑定的州。两个信号状态之间的区别必须至少为3-4个数量级。

设计非均相测定法要简单得多，其中标记的结合对复合物与未结合的标记反应物分离。大多数化学发光反应可以通过用化学发光化合物或用酶标记并使用化学发光底物来适应该测定形式。大多数商业开发的免疫测定都属于这种类型。

化学发光反应

在设计检测方案时有许多已知的化学发光反应可供选择。然而，只有一小部分已知反应已经进入高容量临床诊断测试方法。有几个因素影响特定的化学发光技术是否适用于自动免疫测定。

当然，反应应证明足够的化学发光量子产率。
检测化学的所有方面，包括标记方法，标记试剂，引发剂和化学发光试剂，必须坚固且可重复地制备。使用酶标记的方法面临额外的要求，即酶必须相当稳定并且易于缀合而不降低其催化活性。
理想的化学发光试剂凭借有效的化学发光反应和可预测的光发射时程具有易于测量的信号。
分析性能必须具有高度可重复性。由于测定间和测定内CV通常必须在3-5％的数量级，因此试剂性能不得超过CV的1-2％。当然，试剂不会过度干扰，必须在实验室使用条件下产生稳定和可重复的信号。在1-2周的时间内恒定的试剂性能非常重要，因此可以存储板载校准曲线。
加工和运输考虑要求检测试剂能够批量生产。试剂必须在冷藏温度下或理想地在环境温度下显示出延长的储存稳定性。
测量基础

化学发光作为分析工具的吸引力在于检测的简单性。根据定义，化学发光过程是其自身光源的事实意味着测定方法和用于执行它们的仪器仅需要提供检测光并记录结果的方法。发光计只需要一个不透光的样品外壳和某种类型的光电探测器。考虑到简单性的极端，可以使用照相或X射线胶片或甚至视觉检测。

化学发光方法的简单要求使其坚固且易于使用。但灵敏度呢？

化学发光在这里也有两个内在优势。
1. 大多数样品没有“背景”信号，即它们本身不发光。没有干扰信号限制灵敏度。
1. 化学发光的测量不是荧光和吸收或颜色的比率测量。在荧光中，这可能导致具有小斯托克斯位移的荧光剂的困难。激发波长可能不容易解析荧光。
另一个问题与入射光散射到检测器有关，特别是当样品有些混浊时。

限制吸收测量灵敏度的基本因素是需要测量两个相对较大信号的微小差异。

应注意尽可能地使检测装置的光谱响应与化学发光光谱相匹配，以使灵敏度最大化。通常在发光计中发现的光电倍增管显示出对蓝光的最大响应并且降低了对光谱红端的灵敏度。固态探测器通常具有更好的红色响应。

X射线胶片： X射线胶片广泛用于记录在尼龙，硝酸纤维素或PVDF膜上进行的化学发光印迹分析的图像。用户应该记住，X射线胶片只能检测紫外到蓝色光谱区域的可见光，尽管可以使用具有增强绿色灵敏度的特殊胶片。

在解决方案中检测

在文献和整个网站中定期使用一些术语来讨论化学发光在测定中的用途：灵敏度，线性和动态范围。各自的含义如下所述。
1. 灵敏度是指可以可靠地检测到某物的最低水平。“某物”通常是在测定中检测的分析物。分析物可以用一些可检测的标签标记，例如化学发光化合物或酶。还可以通过与具有标记的亲和结合配偶体的特异性结合反应来检测分析物。在空白测试样品上仍然可以检测到某些信号的最低“可靠”水平受样品基质，信号化合物的性质以及检测器重复检测低水平信号的能力的影响。
2. 线性描述了在分析物浓度范围内信号与分析物量的关系。理想情况下，比例因子应该是恒定的; 信号与分析物的关系图将是一条直线。偏离线性的校准曲线，例如S形或S形曲线，仍然是有用的。
3. 动态范围是分析物浓度的跨度，信号在该浓度范围内以单调方式随浓度变化。这定义了测定的工作范围 - 在大多数情况下越宽越好。
化学发光检测可以达到什么样的灵敏度？不幸的是，答案是'它取决于'。只有在极少数情况下，检测器灵敏度的限制或化学发光输出才能确定可检测性。现代探测器可以感知到极小的强度。大多数情况下，其他因素设法将测定灵敏度限制在远高于检测器施加的水平。最常见的罪魁祸首是生物组分（抗体，酶等）与反应容器和支持物表面的非特异性结合。事实上，所有免疫测定，印迹测定，核酸杂交测定和其他酶联结合测定都受到这种效应的限制。

管和微孔板

玻璃和透明或半透明塑料管和比色皿是用于光测量的合适容器。理想情况下，应通过平面测量光线，以尽量减少边缘效应。可以使用弯曲表面，例如通过圆柱形试管的底部。只有在确定管子均匀制造后，才能比较使用不同管子的结果。

微孔板：化学发光反应中发出的光是各向同性的 - 它在所有方向上均匀发射。如果在透明微孔板的孔中进行化学发光测定，则光不仅在检测器的方向上垂直地辐射，而且在其他孔的方向上横向辐射。光很容易通过井间间隙和板材本身传播，这种现象称为光管道。相对明亮的井将在相邻的井及其他井中引入显着的干扰。出于这个原因，化学发光不应该在透明板上进行测量。

不透明的微孔板和条带可从几个供应商处商购获得。它们分为两种 - 白色和黑色。由于光吸收，使用黑色板的用户会注意到信号显着降低（约10倍）。由于所有孔都按比例受到影响，无论强度如何，定量都不会受到影响。板的选择应基于预期的信号强度，白色用于调光反应，黑色用于更亮的反应。黑色板也可用于有利于减少非特异性结合背景问题。

此外，所有白色板都不是同样不透明的。设计用于荧光的白色板可以比用于化学发光的白色板显着更少的白色颜料。荧光板通常一次仅照射一个孔，这消除了几乎所有的井间串扰。通过将手电筒靠在板背面并用肉眼观察孔，可以很容易地检查白色微孔板的不透明度。对于强烈化学发光的底物，表现出光的透射率低于光的板可能是有问题的。

固相支持物的检测：印迹膜

X射线胶片：多年来人们已经认识到，西方印迹中固定化蛋白质的化学发光检测和南方和北方印迹中的固定化核酸是强有力的组合。在我们的产品应用部分中描述了使用几种Lumigen的化学发光试剂进行印迹分析。

只要充分控制非特异性结合，灵敏度通常对于手头的任务是足够的。如果不是这样，发光反应的能力通常表现在黑化（过度曝光）的X射线胶片中。避免该问题的最佳策略是减少结合试剂的量，即抗体等。1-10分钟的曝光时间通常足以对大多数印迹成像。更长的时间很少改善信号/背景。

Ø在敏感性问题的另一侧，未能记录信号可能不一定表明缺乏分析物。任何类型的摄影胶片都具有阈值强度，低于该阈值强度，银粒子的光化学转化失效。这种效应称为互易失败。实际上，结果是低于一定强度的化学发光信号根本无法记录。更长时间的暴露无法克服这个问题。防止互易性失效的方法包括气体超强，其中在暴露和预闪之前将膜在升高的温度下浸泡在氢气和氮气的混合物中长时间，其中膜用短持续时间的低强度光闪烁在暴露于样品之前提高照相颗粒中的光子底面。

CCD相机成像：相对而言，最近CCD相机系统已成为获取和存储化学发光印迹图像的有竞争力的工具。这些系统在信号测量的动态范围内具有优势。对于X射线胶片，响应是线性的3-4个数量级对比约1个数量级。成像时间更短，可以轻松获得并存储多个图像。虽然预先成本高昂，但它们的使用消除了购买胶片和胶片处理的持续成本，更不用说处理单元的成本了。

仪器仪表：基于光电倍增管的检测

光电倍增管（PMT）传统上是发光计中的主力检测器。它们的优点包括良好的灵敏度，宽动态范围和适用于相当宽的光谱范围。PMT以其非常低的暗电流而闻名，从而为低强度样品提供出色的信噪比。

基于PMT的系统以两种基本模式操作，单光子计数和电流感测。存在混合系统的示例，其是单光子计数到低百万光子/秒的光水平，然后切换到高于该水平的电流感测。

PMT单光子计数系统具有精确的灵敏度。使用这种类型的检测器是低光检测和定量的选择方法，例如，检测与吞噬作用相关的超弱发光。然而，更高的灵敏度需要付出代价。样品外壳必须非常轻。适度的光照水平使探测器饱和; 高水平会对PMT造成不可逆转的损害。

PMT电流传感系统还具有出色的灵敏度，并且通常会比没有损坏的单光子计数系统读取更高的光照水平。

在化学发光仪器领域中存在关于哪个系统“更好”，电流感测或单光子计数的不同意见。在现代的光度计中，两个系统都具有出色的灵敏度并且易于使用。正确理解每个系统的特性应该允许用户选择最适合应用的系统。我们使用这两种类型都有很大的优势，我们的基板可以很好地兼顾。

固态检测

光电二极管能够记录比光电倍增管探测器更高的光强度。这个方面使它们成为要测量高光强度的应用的最佳选择。然而，固态探测器中固有的暗电流通常远高于光电倍增管。减轻该问题的一种方法是通过Peltier或其他热电冷却器冷却固态检测器。固态探测器中的暗电流随温度在0到-30摄氏度范围内急剧下降。然后可以使用冷却的探测器将光强度积分一至数百秒而不会使信号被暗电流淹没。

CCD和其他固态探测器具有以下几个固有优势：
1. 固态探测器通常在可见光范围内提供“更平坦”的光学响应。可以以增强的灵敏度检测发射红光甚至近红外光的发光反应。
2. CCD相机系统允许对各种物体进行成像。事实上，可以容纳任何种类的样品或容器，从微孔板和试管到培养皿中的细菌或细胞培养物，电泳凝胶和印迹膜。
3. 单个PMT系统必须具有良好定义的样品位置才能读取。必须将样品管带到可重复的位置以便可重复读取。微孔板PMT读取器依赖于微孔的标准间隔，并且通常将板移动到预先计算的位置，因此可以逐个读取孔。相机系统具有能够在不知道其位置的情况下读取样本的优点，如在印迹上的带的示例中。相机成像系统提供定位信息以及样品强度。
4. CCD相机系统允许同时成像多个物体。在目前96,384和更高数量的井板时代，并行数据收集不再是奢侈品。固态相机成像系统有可能在一次通过中对整个板进行成像和定量。
如果仪器设计者或最终用户不了解微孔板，则成像检测器具有潜在的严重缺点。渐晕问题源于板相对于简单的二维目标（例如印迹）的三维性质。由于光强度随着到板的距离的平方的倒数而下降，因此假设将相机尽可能靠近板放置将产生最佳结果是合乎逻辑的。但是，由于井有深度，最外层井的整个底部可能不可见。部分发射井的这种几何截止将导致从井中检测到较少的光。

抬高相机会在一定程度上缓解这种情况，但会降低探测器的整体强度。可以应用几何加权模式来校正边缘强度损失，然而，外部井的信噪比必须比中心井的信噪比更差。

可选配件

大多数研究发光计和发光免疫分析仪都包含许多非常有用的辅助成分。样品加热器/冷却器和试剂注射器促进化学过程，从而产生光照。通常提供用于光学过滤的组件，而用于拒绝杂散光的结构特征（例如挡光板和切断开关）是强制性的。一些更重要的配件的好处是：
1. 温度控制：比较天内和天之间的结果有时会受到样品中温度变化的影响。特别是在酶催化的“发光”型反应的情况下，其需要几分钟才能达到平台强度，温度波动会导致测量强度的变化，从而降低分析精度。恒温样品块和板式加热器可以帮助提供均匀的温度，并允许在高温下进行反应。样品强度的变化可以由几种效应引起，包括酶促反应的温度依赖性动力学或随后的底物化学动力学。微妙的影响，例如具有大温度系数的缓冲液的pH偏移，可能导致显着的信号变化。
2. 单色器和光学滤波器可以隔离特定的波长或范围。通常，除专业应用外，不需要使用它们。以在光谱的不同区域发射的两种发光物质为特征的测定和方案有时用于检测两种不同的分析物。使用荧光受体能量转移化合物和化学发光发射体的方案可用于探测结合过程。波长选择性是有代价的，因为任何减少到达检测器的光波长范围的装置都不可避免地通过降低光通量来降低灵敏度。
3. 中性密度滤光片是有用的光学元件，用于将发光计可测量的光强度范围扩展2-3个数量级。这些滤光片由一块特殊的浅灰色玻璃组成，安装在样品架和探测器之间，其功能类似于“太阳镜”，可以通过已知因素减少基本上所有波长。通过应用校正因子将测量的光强度校正为“真实”强度。
4. 喷油器 允许在精确时间引入基板或触发器。当动力学控制的样品具有时变光线曲线时，这可能是重要的。可以在曲线的生长部分读取一些底物，并且只有在底物或触发物引入后在完全相同的时间读取所有孔或管时才能产生准确的结果。注射器使用的警告源于化学发光测量的极高灵敏度。如果注射器系统被污染或者如果要在同一仪器上使用不同的基板系统，则注射器系统可能非常难以彻底清洁。一些底物可以检测少至几百个其触发剂分子。清洁活塞，注射器针筒，
参考

化学发光测量的一般讨论可以在这些文章中找到。
1. JE Wampler，Instrumentation：See the the Light and Measuring It，Chemi- and Bioluminescence，JG Burr，ed。，Marcel Dekker，New York，1-44（1985）。
2. AK Campbell，化学发光的检测和定量，化学发光原理和生物学和医学中的应用，Ellis Horwood，Chichester，68-126（1988）。
3. F.Berthold，化学发光免疫测定仪器，发光免疫测定和分子应用，K.Van Dyke和R.Van Dyke，eds。，CRC Press，Boca Raton，11-25（1990）。
4. T.Nieman，Chemiluminescence：Theory and Instrumentation，Overview，in Encyclopedia of Analytical Science，Academic Press，Orlando，608-613（1995）。